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摘要：将工业生产产生的副产品饼干渣加入发酵培养基中，通过单因素和正交试验对乳酸球菌RL-68生产菌种工业培养基进行优化，确定发酵优化条件为：饼干渣105 g/L、番茄汁3%、最适碳氮比7，在培养温度35 ℃、发酵初始pH值6.5～6.8条件下培养，这时乳酸球菌RL-68活菌数最高，可达7.32×109 CFU/mL。
关键词：乳酸球菌；工业培养基；优化；配方；发酵工艺；正交试验
中图分类号： TQ920.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0285-03
收稿日期：2013-10-14
基金项目：国家级大学生创新创业计划（编号：201210376003、201310376006）；皖西学院研究性学习项目（编号：wxxyx2013062、wxxyx2013074）；安徽省高校自然科学基金（编号：KJ2011B216）。
作者简介：孙传伯（1978—），男，安徽桐城人，硕士，讲师，研究方向为生物质能工程。E-mail：scb19781979@126.com。乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌[1-5]。乳酸菌是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种，除极少数外，绝大部分都是人体内必不可少且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。目前，已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。乳酸球菌是乳酸菌的一种，是工业上尤其是食品工业上的常用菌种，存在于乳制品、发酵植物食品（如泡菜、酸菜）、青贮饲料及人的肠道尤其是乳儿肠道中，具有发酵温度高、产酸率相对较高、对糖利用率高、发酵时不需通氧气等优点，在工业生产上具有非常广阔的应用前景。目前，世界上对于生产乳酸球菌的培养基有很多研究，但使用的多是实验室试剂，成本较大。本试验运用工业生产产生的副产品饼干渣和玉米浆来代替生产乳酸球菌的碳源和氮源，探索简单、低成本、高产量的适用于实际工业生产的发酵培养基[6]。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验菌种与材料乳酸球菌RL-68，由皖西学院生物质炼制技术工程研究中心提供；饼干渣，由桐城双武食品厂提供；番茄、香蕉、白菜、橘子、苹果，均购自安徽省六安市南门菜市场。
1.1.2主要仪器722分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产；250B恒温培养箱，江苏金坛精达仪器制造厂生产；PHS-3C pH计，上海仪电科学仪器有限公司生产；SW-CJ-1D超净工作台，苏州净化设备有限公司生产。
1.1.3培养基活化培养基（g/L）：酵母膏 5、蛋白胨 5、葡萄糖 40，pH值6.0～6.5，115 ℃灭菌15 min；种子培养基（g/L）：酵母膏10、蛋白胨10、葡萄糖50、乙酸钠0.5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.01、ZnSO4·7H2O 0.2，初始pH值为6.5～6.8，0.1 MPa 下灭菌20 min[7-10]；发酵基础培养基（g/L）：蛋白胨15、葡萄糖120、乙酸钠0.5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCL 0.01、ZnSO4·7H2O 0.2，初始pH值6.5～6.8，0.1 MPa下灭菌20 min[11-13]；平板计数培养基（MC培养基，g/L）：大豆蛋白胨5、牛肉膏粉5、酵母膏粉5、葡萄糖20、乳糖20、碳酸钙10、琼脂15、中性红0.05，pH值6.0±0.2，0.1 MPa下灭菌20 min[14-16]。
1.2方法
1.2.1培养方法种子培养：发酵培养前，经2次传代后，挑几环乳酸球菌RL-68菌体接种于装有300 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，用封口膜封口，37 ℃恒温静置培养；发酵培养：500 mL锥形瓶中装入300 mL发酵基础培养基，取培养好的种子培养液，按体积分数1%接种量接种，恒温静置培养30 h[17-20]。
1.2.2测定方法活菌计数方法：平板涂布法，选择3个合适的稀释度，每个稀释度做3个平皿，菌落数为3个平皿的平均值；菌液吸光度测定方法：722型分光光度计在620 nm条件下比色；pH值测定方法：pH计测定。
1.2.3乳酸球菌的生长曲线按体积分数1%的接种量将种子培养基接种于发酵培养基中，静置培养，分别于10、12、14、16、18、20、24、26、30 h取样测定培养基的吸光度（D值）。
2结果与分析
2.1乳酸球菌生长曲线
在种子培养过程中，分别于4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、30 h取样测定培养基的D值。由图1可见，在前8 h，D值没有明显的变化，此时乳酸球菌处于延迟期，细胞正合成分裂所需要的物质；在8～12 h D值有升高，在12～18 h D值有明显的升高，表明菌种生长进入对数期；18 h 后D值基本保持不变，即菌种进入稳定期。为缩短菌种转入发酵液中的延迟期，选择种子培养中对数期的培养液较好，故选择18 h作为接入发酵液的时间。
2.2发酵培养基的单因素试验
2.2.1发酵培养基中碳氮比的影响试验采用工业生产副产品饼干渣作为碳源，改变发酵基础培养基中的碳氮比，基础培养基中其他组分不变，37 ℃静置培养24 h后测定活菌数[21-22]。由表1可见，当碳氮比小于5或者高于8时，培养基中活菌数数量级明显下降，这说明乳酸球菌RL-68对于碳氮源的利用有其自身的最适度，当碳氮比为7时，培养基中的活菌数最高，可达到1.96×108 CFU/mL，故选取碳氮比为7作为优化培养基的最适碳氮比。
3小结与讨论
通过单因素和正交试验，确定最佳发酵培养基和培养条件为：饼干渣105 g/L、蛋白胨15 g/L、番茄汁3%、最适碳氮比7、培养温度35 ℃、静置培养18 h，产菌量可达最高，为732×109 CFU/mL。本试验利用工业生产产生的副产品为主要原料，获得一个简单、低成本、高产量、适用于实际工业生产的发酵培养基。但是，本试验还有待进一步深入研究，如碳氮源固定比例问题是否可根据生产实际情况进一步调整。另外，利用番茄汁和橘子汁发酵得到的活菌数是在同一数量级的，但由于试验时不是橘子的成熟季节，故选取了番茄汁，在后续试验中，对生长因子的影响将进一步开展研究。
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发表于 2022-2-21 20:35:18