基于高压制备液相的多维色谱技术在中药分离纯化中的应用

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工作中[9～11]。本文介绍了基于高压制备液相的多维色谱系统的基本原理和关键技术，并综述了其在中药分离纯化中的应用。
2 高压制备液相系统的多维色谱技术
由于天然产物、中药及代谢产物等样品的复杂性，传统的一维色谱在一次运行中，常常受峰容量（Peak capacity）和分辨率的限制，不能满足分析和分离的需要[12]。根据Giddings等[13]的研究，多维分离模式的峰容量应为其构成的各个一维分离模式的峰容量的乘积，这使得在一定时间内从色谱柱中洗脱出来并达到一定分离度的色谱峰的数量大大增加，多维色谱（Multidimensional chromatography， MDC）技术也因此而得到了迅速发展[14]。高压制备液相的多维色谱是在高压制备液相色谱的基础上，通过阀门控制或离线再进样操作，结合其它分离机制或分离模式的色谱技术而形成的一项能对复杂样品实现高容量分离纯化的新技术，可实现样品不同组分在一次操作中的多次分离。它不仅能提高色谱体系的峰容量和正交性[7，15]，还能降低色谱峰之间峰重叠[16]，使得多组分样品、含量差异大样品，性质相似样品的分离制备成为可能。
2.1 分离模式
根据两维间洗脱馏分是否直接进行连续性分离，可将多维色谱技术分为离线模式和在线模式。离线模式[17]指洗脱馏分不直接进行连续性分离，这种操作模式溶剂选择性广，对仪器要求不高，峰容量大[18]，但步骤繁多，自动程度不高，耗时耗力，样品损失较多。对应于离线模式，在线模式是通过仪器系统自身对样品进行捕获、富集，最终实现多次分离的模式[19]，这种模式自动化程度高，连续性强，但对溶剂的兼容性要求较高。
二维以上的多维制备色谱通常结合了离线模式与在线模式，这种多维制备色谱更适用于性质相近、结构相似的组分的分离纯化。然而，多维的分离操作会导致样品的损失量增大，因此在分离分析过程中需要确保足够的样品量。
2.2 制备色谱柱
与分析型色谱柱相比，制备型色谱柱的上样量和流速都可以提高3至4个数量级，甚至更高。制备色谱虽然不是分析色谱的简单放大，但是两者可以通过线性放大系数关联起来。线性放大的基本假设是分析色谱系统和制备色谱系统的化学性质、传质过程都保持不变，而进样量、流量、收集体积等乘以线性放大系数，线性放大系数即为制备色谱柱截面积和分析色谱柱截面积之比[20]。
色谱柱的选择要根据样品的性质，对疏水性样品可以选择反相色谱柱，亲水性样品可选正相色谱柱和亲水色谱柱，生物大分子可选择离子交换色谱柱，碳水化合物可用疏水作用色谱柱，无机离子可使用离子色谱柱，合成聚合物可采用凝胶色谱柱，立体异构可采用环糊精固定相，而外消旋体样品则可以考虑手性色谱柱[21]。在实际操作过程中，可以根据样品、色谱柱以及流动相的特点，合理设计实验对样品进行纯化。Zhang等[22]通过以NaHCO3缓冲液和0.035%三氟乙酸作为pH调节剂，根据在不同pH值条件下，色谱柱和样品在流动相选择性不同，从复杂样品中纯化出33种化合物单体。Wei等[23]采用苯基己基色谱柱，这种色谱柱在乙腈作用下对三酰基甘油具有疏水作用，而在甲醇作用下对三酰基甘油具有ππ键相互作用，实验成功从不同食用油中分离纯化出多种化合物单体。
2.3 在线多维色谱关键技术
多维的分离虽然为药物研究带来很大便利，然而如何解决不同维度溶剂体系兼容性问题，如何构建转换接口以实现两维溶剂体系的转换，以及如何利用制备色谱柱等因素设计实验对复杂样品进行有效的分离纯化仍是影响多维色谱发展的核心问题。
2.3.1 分离体系兼容性 影响分离体系兼容性的最主要因素是不同维度之间溶剂与溶剂、溶剂与样品兼容性问题。只有对两者进行合理的匹配，才可能实现最佳的分离效果。可以通过以下方法解决溶剂体系兼容性问题：
（1）使用兼容性溶剂 使用兼容性溶剂是解决该问题最简单、最直接的办法。陈芳芳[24]根据分子排阻色谱和反相色谱不同的分离机理，采用Sephadex LH20中压柱作为第一维，以C18制备色谱柱作为第二维，构建了具有正交性的全二维在线中压液相×制备型高效液相色谱的制备液相色谱系统（MPLC×prepHPLC），两维都以甲醇/水为流动相，样品在经第一维洗脱分离后储存在富集柱上，然后被交替送入第二维制备液相色谱柱进行进一步分离，在经历了两种分离机制的色谱柱分离后，获得18种纯化的化合物单体。