废丝废茧蛋白对小球藻和四尾栅藻生长的影响

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摘要：缫丝汰头中含有丰富的废丝废茧蛋白质。采用酸水解法得到的游离氨基酸水解度为87.33%。利用单因素试验设计研究氨基酸水解液添加量、温度和通氧量对小球藻（Chlorella）和四尾栅藻（Scenedesmus quadricanda）生长的影响。结果表明，氨基酸水解液的添加量为5.00%、温度25 ℃、通氧量1.5 L/min的条件对小球藻和四尾栅藻的生长有极大的促进作用。
关键词：缫丝汰头；氨基酸水解液；小球藻（Chlorella）；四尾栅藻（Scenedesmus quadricanda）；细胞密度
中图分类号：S968.41 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2107-04
种桑养蚕以及桑蚕丝加工一直是我国的优势产业，随着缫丝产业的蓬勃发展，缫丝汰头废水排放是目前缫丝企业所面临的一个重要问题。一方面缫丝厂废弃蛋白的排放会对自然环境造成一定的污染，另一方面废弃蛋白中珍贵的蚕丝蛋白质资源被浪费[1-4]。如果能有效地利用缫丝废弃蛋白质生产鱼塘氨基酸肥水剂，不但可以减轻缫丝厂传统废弃物处理的成本和压力，而且还能切实开辟缫丝废弃物的全新使用途径。从汰头中提取丝胶的方法有化学提取法和物理提取法两大类[5]，得到的粗丝胶蛋白可与废丝一起水解，蚕丝水解采用微波、酸、碱、氯化钙和酶等[6-11]。水解后可得到16种氨基酸的混合物，其中包含6种人体自身不能合成的氨基酸，因此可以用于食品和化妆品的添加剂，一些含量较高的氨基酸还具有药用价值。
氨基酸肥水剂由多种氨基酸、营养盐、微量元素、维生素及酵素菌等多种活性物质和生长因子组成，通过激活有益微生物繁殖和激活藻类细胞分裂及孢子萌发，促进单细胞藻类新陈代谢，协调藻相与菌相平衡，促使水体迅速肥沃和维持水质稳定，丰富水体天然饵料，提高鱼虾幼苗成活率，促进鱼虾生长。同时能有效防止浮头或翻塘，降低水中氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有毒物含量，减少疾病发生。氨基酸肥水剂产品越来越受到社会各界的普遍欢迎。
试验所选的小球藻（Chlorella）和四尾栅藻（Scenedesmus quadricanda）同属绿藻门（Chlorophyta），是鱼类在不同生长时段可利用的天然水生饵料。小球藻作为单细胞微藻的一种，直径3～8 μm，富含蛋白质、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、叶黄素、虾黄素和多种维生素，具有极高的营养价值和提高免疫力的功能[12]，可作为鱼类的开口饲料。四尾栅藻作为栅藻类的一种，直径10～24 μm，能为鱼类快速生长过程提供营养。本研究利用缫丝废弃蛋白中回收的蛋白质为材料，利用酸水解法得到氨基酸水解液，用氨基酸水解液代替无机盐NaNO3提供氮源，研究氨基酸水解液的添加量、温度和通氧量对小球藻和四尾栅藻生长的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
缫丝汰头来自广西鸿艺丝绸有限公司，小球藻和四尾栅藻购自中国科学院水生生物研究所。
主要试剂：H2SO4、NaOH、HCl、甲醛、石油醚等均为分析纯，试验用水为蒸馏水。
主要仪器：PHS-25CW型pH计（上海理达仪器厂）、XYJ80-1型离心机（江苏省金坛市正基仪器有限公司）、DMB5电子显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）、LRH-250培养箱（广东省医疗器械厂）、HP-1000通氧机（广东中山创新电器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 丝胶蛋白的回收 采用酸析法与离心法相结合，在缫丝汰头废水中加入稀HCl，调整pH为3.8～4.5，在等电点条件下使丝胶蛋白质絮凝而逐渐沉淀分离[5]。取沉淀后的溶液4 000 r/min离心30 min，用抽滤装置进行浓缩，按固液比（m/V，g/mL，下同）为1∶10向沉淀中加入石油醚，6 ℃下密封静置24 h，然后置于低于40 ℃的鼓风干燥箱中干燥至恒重，即为粗蛋白粉。将缫丝汰头废丝用清水洗净，置于低于40 ℃的鼓风干燥箱中干燥至恒重。
1.2.2 丝蛋白的水解 称取1.0 g缫丝汰头废丝和1.0 g粗蛋白粉置于500 mL蒸馏瓶中，按固液比1∶60加入3.5 mol/L的稀H2SO4溶液，恒温加热搅拌器110 ℃反应9 h[13]，冷却，用Ba（OH）2完全中和。将中和滤液减压过滤，取上清液4 000 r/min离心30 min，彻底除去BaSO4沉淀，得到溶液即为氨基酸水解液。水解度以水解液中氨基氮与废弃蛋白中总氮的百分比表示[14]。
1）考察氨基酸水解液添加量对小球藻和四尾栅藻生长的影响。试验设置8个氨基酸水解液处理组和1个BG11培养液对照组。氨基酸水解液处理组用pH 7.0的氨基酸水解液替代BG11培养液中的NaNO3，分别添加0.25%、0.50%、2.50%、5.00%、7.50%、10.00%、15.00%、20.00%的氨基酸水解液。每组设3个平行。温度28 ℃，光照度5 000 lx[16]，培养16 d，每隔2 d于上午10∶00进行藻细胞计数，测定藻细胞密度。
2）考察温度对小球藻和四尾栅藻生长的影响。将小球藻和四尾栅藻溶液分别置于10、15、20、25、30、35 ℃下，光照度5 000 lx，通氧量I.5 L/min，培养7 d，于每天上午10∶00进行藻细胞计数，并计算其平均增长量。
3）考察通氧量对小球藻和四尾栅藻生长的影响。将小球藻和四尾栅藻溶液以不同通氧量（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 L/min）处理，光照度5 000 lx，温度28 ℃，培养7 d，于每天上午10∶00进行藻细胞计数，并计算其平均增长量。
2 结果与分析
2.1 废丝蛋白的回收率
丝胶蛋白的等电点为3.8～4.5，当丝胶蛋白溶液的pH在此范围内时，丝胶蛋白的絮凝量最大。因此，一般将初滤除杂的废水pH调整至4.0，以提高丝胶蛋白的回收率。本研究中丝胶蛋白回收率为7.33%。
2.2 氨基酸水解度
水解液中氨基氮为14.03 mg/mL，水解度为87.33%。这与李勇等[13]研究的水解蚕丝及其饮料的制备中氨基酸得率为89.8%的结果基本一致。
2.3 氨基酸水解液添加量对小球藻和四尾栅藻生长的影响
氨基酸水解液添加量对小球藻生长的影响如图1所示。从图1中可以看出，前6 d为迟缓期，各组小球藻的生长缓慢；6～10 d为对数生长期，各组小球藻的生长趋势明显不同；10～12 d为稳定期，藻细胞密度达到最大值；12～16 d为衰亡期，随着培养基中营养元素不断被消耗，小球藻的生长受到抑制，藻细胞密度趋于平稳；并且随着氨基酸水解液添加量的增加，抑制作用更为明显。添加0.25%、0.50%、2.50%、5.00%、7.50%、10.00%、15.00%、20.00%的氨基酸水解液时，小球藻的细胞密度均明显高于对照组，说明氨基氮的添加能促进小球藻的生长。其中氨基酸水解液的添加量为5.00%时对小球藻生长的促进作用最大。
氨基酸水解液添加量对四尾栅藻生长的影响如图2所示。从图2可以看出，前6 d为迟缓期，各组四尾栅藻的生长缓慢；6～10 d为对数生长期，各组藻的生长趋势明显不同；10～12 d为稳定期，藻细胞密度达到最大值；12～16 d为衰亡期，随着培养基中营养元素不断被消耗，四尾栅藻的生长受到抑制，藻细胞密度趋于平稳。添加0.25%、0.50%、7.50%、10.00%、15.00%、20.00%的氨基酸水解液时，四尾栅藻的细胞密度均低于对照组，四尾栅藻的生长受到抑制，并且随着氨基酸水解液添加量的增加，抑制作用表现得更为明显；添加量为2.50%和5.00%时，四尾栅藻的细胞密度明显高于对照组。且以氨基酸水解液添加量为5.00%时对四尾栅藻的促进作用最大。
2.4 温度对小球藻和四尾栅藻生长的影响
2.5 通氧量对小球藻和四尾栅藻生长的影响
藻类进行自养生长时会利用CO2释放出O2，培养基中通入大量的无菌氧气能够加强藻液混合，促进藻细胞在光区和暗区之间循环运动，从而提高藻细胞密度。通氧量对小球藻生长的影响如表3所示。由表3可知，通氧量在0～1.5 L/min区间内，随着通氧量的增大及生长时间的延长，小球藻的细胞密度逐渐增大，日均增长量为（15.70～19.61）×104 cells/mL，说明适量的氧气通入会促进小球藻的生长，提高其繁殖速度，当通氧量为1.5 L/min时藻细胞密度达到最大，日均增长量为19.61×104 cells/mL；通氧量在2.0～2.5 L/min区间内，随着通氧量的增大，小球藻的细胞密度增长放缓，日均增长量从15.49×104 cells/mL降至10.79×104 cells/mL，说明通氧量过大会抑制小球藻的生长，降低其繁殖速度。因此，小球藻的最适通氧量为1.5 L/min。
通氧量对四尾栅藻生长的影响如表4所示。通氧量在0～1.5 L/min时，随着通氧量的增加及生长时间的延长，四尾栅藻的细胞密度逐渐增大，日均增长量为（15.91～19.34）×104 cells/mL，表明少量的氧气通入会促进四尾栅藻的生长，提高其繁殖速度，当通氧量为1.5 L/min时，藻细胞密度达到最大，日均增长量为19.34×104 cells/mL；通氧量在2.0～2.5 L/min区间内，随着通氧量的增加，四尾栅藻的细胞密度增长放缓，日均增长量从16.99×104 cells/mL降至10.79×104 cells/mL，表明大量的氧气通入会抑制四尾栅藻的生长，其繁殖速度受到影响。因此，四尾栅藻的最适通氧量为1.5 L/min。可能是当光照到培养液表面时，藻本身对光有遮挡作用，故入射光穿透培养液时存在不断衰减的现象，且随着藻细胞密度的增加，这种光衰减现象会不断加重，增加通氧量会加强培养液的混合，使每一个藻细胞接受均等的光照机会。但通氧量过大使之对细胞的剪切力加大，反而不利于藻的生长[19]。同时，营养液中氧气过量能够降低藻类对CO2的利用，抑制藻类的自养生长，繁殖速度降低。
3 结论
本研究以缫丝厂汰头废弃蛋白中回收的蛋白质为材料，将丝胶蛋白回收技术与缫丝汰头处理相结合，研究制备一种氨基酸肥水剂。利用酸析法与离心法相结合的方法回收缫丝汰头废水中的丝胶蛋白，回收率达7.33%。蛋白质水解得到的游离氨基酸的水解度为87.33%。用氨基酸水解液代替无机盐NaNO3提供氮源，当氨基酸水解液的添加量为5.00%时小球藻和四尾栅藻的生长状况最好。小球藻和四尾栅藻生长最适温度为25 ℃，最适通氧量为1.5 L/min。从本研究结果可以看出，利用缫丝厂废弃蛋白的氨基酸水解液代替无机盐NaNO3对小球藻和四尾栅藻的生长有一定的促进作用。在以后的研究中可以通过改变培养液中P、S、Mg等元素的浓度以及添加有益菌群和维生素，制备出一种最适合藻类生长的氨基酸鱼塘肥水剂。
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